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大家都在做的GST pulldown实验,究竟有什么魔力?

一、GST pull-down基本知识

1、GST pull-down概念

GST pull-down:是利用重组技术将探针蛋白与GST谷胱苷肽巯基转移酶融合,融合蛋白通过GST与固相化在球珠上的GSH谷胱甘肽结合。从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。


2、GST pull-down 研究对象



二、GST pull-down 原理

1、GST pull-down结合原理


2、GST pull-down 分离原理



三、GST pull-down 流程

1、蛋白的抽提与纯化:

①原核表达蛋白纯化


②真核表达蛋白抽提


2、体系孵育与pull-down


3、考染检测与WB验证



四、GST pull-down 结果

1、GST pull-down 结果分析

①考马斯亮蓝检测


②Western blot验证


五、GST pull-down 拓展

1、GST pull-down 与Co-IP区别

①GST pull-down


②Co-IP


GST pull-down 与Co-IP区别:

GST pull-down是原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果,只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明;

Co-IP实验是细胞内高表达目的蛋白,并通过IgG球珠-抗体-蛋白复合物体系,分离出互作的蛋白复合物,是细胞内的体内反应结合。


2、GST pull-down 实验优点

①可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作。

②GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强,洗脱纯度高。


3、GST pull-down实验缺点

①验证互作是在试管中进行的生化反应,不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态。

②融合表达的GST标签,肽链较长,可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。


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