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CRISPR+ 单细胞测序 =?


相信大家两大热门技术,单细胞RNA测序技术和CRISPR都耳熟能详。今天与大家一起学习一下近年来一个提出的一项热门技术:通过单细胞RNA测序的CRISPR基因筛选 (CRISPR droplet sequencing)。

知识回顾

首先先和大家简单回顾一下两门热门技术:单细胞测序CRISPR魔剪

单细胞测序

 
单细胞生物学是当今热门话题。在这一领域中,最前沿的要数单细胞RNA测序(scRNA-seq)。传统“批量的”RNA测序方法(RNA-seq)可以一次处理成千上万个细胞,并得到变异的水平。对于多细胞生物来说,细胞与细胞之间是有差异的。当然了,这个差异大小不一。相对比,scRNA-seq则可以揭示出每个细胞独特的微妙变化,甚至可以揭示全新的细胞类型。简而言之,单细胞测序就是在细胞层面上测序,进而回答相关的生物学问题

CRISPR基因筛选(CRISPR screens)

利用功能缺失的策略进行的高通量遗传筛选,是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。CRISPR技术的兴起,使高通量筛选基因更加快速简便,并能准确的实现基因组敲除等编辑功能,因而成为一种强大的遗传筛选工具。相比之前的RNAi干扰的方法,应用CRISPR技术进行的基因敲除更加稳定,确保基因功能完全缺失,是研究人员快速发现新靶点新基因的重要方法。

为什么需要把两种技术结合起来?

CRISPR基因筛选,可以通过 CRISPR gRNAs 靶向不同细胞中成百上千各异的基因,然后通过实验筛选编辑细胞,gRNA 可以帮助确定哪些基因对于生物学作用机制具有至关重要的作用。然而,这种筛选方法比较适用于回答与细胞生长能力直接相关的问题,例如鉴定保护癌细胞免受化疗或免疫细胞抵抗HIV感染的基因。然而,如果我们想研究基因调控和其它复杂的生物控制机制,就要明白多个基因是如何协同工作还有调控调节细胞状态。这就需要针对每个CRISPR靶向基因,分别进行培养,编辑和分析细胞。这样的过程既操作繁琐,又费用昂贵。另外,传统单细胞测序由于细胞筛选导致的不足,常常无法直接用于筛选编辑基因。


由于上述两种原因,我们需要一种新的技术,将两种技术的优势相结合,克服各自技术的不足。所以科学家创造性地发明了CROP-seq(CRISPR droplet sequencing,CRISPR液滴测序)。这种技术能大规模完成前所未有的高通量基因调控的分析。类似于混合筛查,这新方法使用CRISPR-Cas9系统在单个样本中并行生成多达数千个遗传扰动,利用单细胞RNA-seq(scRNA-seq)作为读数,同时测量每个细胞的扰动和表型。

应用实例

Jaitin DA 等人利用CROP-seq表明了使用同一单元格分析基因组扰动和转录组,可以使我们能够同时阐明多种因素的功能及其相互作用。他们使用CROP-seq成功探测关于先天免疫的调节回路的问题。通过对体外和小鼠中数以万计的干扰细胞进行取样,他们鉴定了发育和信号相关因子之间的相互作用和减少。这些包括Cebpb和Irf8在调控单核细胞/巨噬细胞与树突细胞谱系方面的相反作用以及单核细胞中的Rela和Stat1 / 2与病原体对树突细胞的响应的差异功能。这研究证明CROP-seq是可以用于广泛不同的研究领域,进而全面阐明哺乳动物是如何控制特定的回路。

今天就与大家简单介绍到此,有兴趣的同学可以详细读读应用实例中的文章(参考3),进而对此技术有一个更加深刻的理解。于此同时我也希望和大家讨论一下,如果这个CROP-seq可以怎样应用到植物中?然后又会有什么前景?欢迎大家在留言区评论讨论。

参考:

  1. Nature新技术:CRISPR 单细胞测序=? http://www.cmt.com.cn/detail/1282457.html

  2. 怎样追上CRISPR技术快速发展的步伐?https://www.cyagen.com/cn/en/community/frontier/information-20170308.html

  3. Jaitin, Diego Adhemar, et al. “Dissecting immune circuits by linking CRISPR-pooled screens with single-cell RNA-seq.” Cell 167.7 (2016): 1883-1896.


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